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颜宁团队PNAS发表研究提出了通用解析膜蛋白的方法

作者:万博体育app   来源:  时间:2022-04-03 10:06  点击:

  约30%的编码基因编码的膜蛋白(MPs)在众多生理过程中起着至关重要的作用。膜蛋白是超过FDA批准药物一半的靶标药物。需要在近乎生理条件下对功能性膜蛋白进行高分辨率的结构研究,以提供深入的机理理解并促进药物发现。随着单粒子冷冻显微镜(cryo-EM)的分辨率革命,分离的膜蛋白的结构阐明已取得了快速进展。下一个挑战是保留电化学梯度和膜曲率,以便对膜蛋白进行全面的结构阐明,而膜蛋白的生物学功能依赖于这些化学和物理特性。

  2020年7月17日,颜宁团队在PNAS在线发表题为“Cryo-EM analysis of a membrane protein embedded in the liposome”的研究论文,该研究以特征明确的AcrB为原型,提出了一种方便的工作流程,用于对嵌入脂质体中的膜蛋白进行冷冻-EM结构分析。结合优化的蛋白脂质体分离,冷冻样品制备和有效的颗粒选择策略,以3.9的分辨率获得了嵌入脂质体中的AcrB的三维(3D)重建。该研究方法可广泛应用于具有独特可溶域的膜蛋白的冷冻EM分析,为功能受跨膜电化学梯度或膜曲率影响的整体或外围膜蛋白的冷冻EM分析奠定了基础。

  生物膜包围着拓扑隔离的隔室,包括细胞和细胞器,并为各种完整的和外围的膜蛋白(MP)提供了栖息地。这些物理屏障使生命必需的电化学梯度得以生成和维持,这是由于离子和化学物质在整个不可渗透膜上的不对称分布所致。各种生理过程都取决于这些梯度,例如由质子梯度(质子动力)驱动的三磷酸腺苷(ATP)合成和依赖跨膜电场存在的动作电位。因此,许多膜蛋白,例如电压门控离子通道(VGIC)以及一级和二级活性转运蛋白,都依赖于跨膜电化学梯度来执行其生物学功能。

  除了驻留在膜的内部或表面之外,膜蛋白与膜之间的相互作用也对细胞寿命产生了深远的影响。例如,许多外周膜蛋白定义了细胞器形成的膜轮廓。FoF1 ATP合酶的二聚化在塑造线粒体cristate中起着重要作用。机械敏感通道通过部分由膜变形施加的机械力控制。

  当X射线晶体学是确定结构的主要方法时,解析膜蛋白的结构曾经极具挑战性。必须从破裂的膜中纯化出高度均质的膜蛋白,并用精心选择的去污剂取代以结晶。自2013年以来,冷冻电子显微镜(cryo-EM)单颗粒分析(SPA)已成为膜蛋白高分辨率结构解析的主流手段。已应用多种试剂将膜蛋白溶解为单个颗粒以进行分析。除了去污剂微团外,两亲,纳米圆盘和苯乙烯-马来酸脂质颗粒(SMALP)封闭的带有天然膜的纳米圆盘也已用于成功的膜蛋白冷冻-EM结构分析 。

  尽管取得了这些进步,但所有上述膜蛋白分离方法都破坏了膜的拓扑结构,即使在SMALP环绕的带有天然膜片的纳米盘的情况下,也消除了任何现有的电化学梯度和膜曲率。为了保留这些重要特性,使用电子冷冻断层扫描(cryo-ET)的原位结构分析可能是最终的解决方案。然而,当前的技术障碍阻止了使用cryo-ET的高分辨率原位结构测定。另一种替代策略是研究嵌入脂质体中膜蛋白的结构,该结构已广泛用于膜蛋白的功能分析。

  尽管使用蛋白脂质体进行了广泛的功能表征,但仅有有限的尝试将这种系统用于膜蛋白的结构阐明。在过去的十年中,已经开发了诸如随机球形约束(RSC)之类的方法来研究具有改进SPA策略的蛋白脂质体系统。但是,要在两个报告中执行精确的角度分配或信号减法,目标蛋白脂质体必须是接近完美的球体,这是很难获得的前提条件。两种方法都还需要对原始图像进行额外的预处理步骤。

  为了将cryo-EM用于嵌入或附着在脂质体上的膜蛋白的结构分析,有必要为膜蛋白掺入,冷冻样品制备和cryo-EM数据处理开发高度可重复且方便的工作流程。为此,研究人员选择了来自大肠杆菌的经过充分研究的耐多药转运蛋白AcrB作为方法开发的原型。质子梯度驱动的AcrB是一种三聚体,分子量约为350 kDa。它是即使在低纯度和低浓度下也最易于结晶的膜蛋白之一。因此,AcrB的结构是在早期确定的。到目前为止,在蛋白质数据库(PDB)中使用X射线晶体学和单颗粒冷冻EM方法测定的AcrB结构超过100种,为结构验证提供了极好的参考。

  在这项研究中,报告了一种工作流程,该流程具有优化的脂质体分离,低温样品制备,深层二维(2D)分类,用于数据处理。使用该研究的简化方法,获得了3.9分辨率的蛋白脂质体中AcrB的重建。该工作流程可轻松推广到蛋白脂质体中膜蛋白的结构测定中,并为使用蛋白脂质体系统在受控的电化学势或膜曲率存在下膜蛋白的结构分析奠定基础。

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